原发性肾上腺皮质功能减退症的诊断依据是，外源性ACTH无法使血清皮质醇水平升高。
继发性肾上腺功能不全可通过延长ACTH刺激试验、胰高血糖素刺激试验或胰岛素耐量试验进行诊断。
若怀疑肾上腺危象，需待患者恢复后，方可进行ACTH刺激试验以确诊原发性肾上腺皮质功能减退症。
在ACTH刺激试验中，静脉或肌肉注射250mcg合成促肾上腺皮质激素（cosyntropin）。服用糖皮质激素或螺内酯的患者应在检测当天停用这些药物。
在给予促皮质素后，分别于基线、30分钟和60分钟测量患者的血清皮质醇水平。正常注射前血清皮质醇水平因实验室检测方法而异（应核实所用实验室的正常参考范围），但通常在5~25mcg/dL（138~690nmol/L）之间。原发性肾上腺皮质功能不全患者的注射前皮质醇水平偏低或处于正常低值，且在注射后30分钟时其峰值水平未能超过15~18 mcg/dL（414~497 nmol/L）。
如果在 30 分钟或 60 分钟时皮质醇峰值水平低于 18 微克/分升（500 纳摩尔/升），则很可能存在肾上腺功能不全（具体的阈值值取决于检测方法）（1）。
对促肾上腺皮质激素的反应低于正常水平，也可能出现在继发性肾上腺功能不全中。然而，由于垂体功能衰竭可能会导致肾上腺萎缩（从而导致对促肾上腺皮质激素的反应失效）。 若怀疑垂体疾病，可能需要在ACTH兴奋试验前，每日肌注长效ACTH 1 mg，连续3天，以恢复肾上腺对ACTH的反应性。在这样的启动后，血清皮质醇水平应正常升高至> 20 mcg/dL（> 552 纳摩尔/升），尽管该阈值取决于检测。
延长的ACTH兴奋试验 （24小时取样）可用于诊断继发性（或三发性，即下丘脑性）肾上腺皮质功能减退症。给予促肾上腺皮质激素1 mg 肌内注射，并于注射前（基线）及注射后特定时间点（通常为1、6、12和24小时）测定皮质醇水平，持续监测24小时。在继发性肾上腺功能不全的情况下，30分钟和60分钟时的皮质醇水平会低于正常值，但会在24小时内逐渐升至正常。然而，这项检测很少被采用，因为其结果很大程度上取决于血浆促肾上腺皮质激素的水平。
在短时（30 至 60 分钟）和长时间的促肾上腺皮质激素刺激试验中，第一个小时的血清皮质醇水平是相似的。然而，在原发性肾上腺功能不全的情况下，60 分钟后皮质醇水平不会再有进一步的升高。在继发性和三发性肾上腺皮质功能减退症中，皮质醇水平在≥24小时内持续升高。
在胰高血糖素刺激试验中，在继发性肾上腺功能不全患者中，血浆促肾上腺皮质激素和皮质醇水平未能因胰高血糖素而升高。
在胰岛素耐量试验中，静脉注射足量常规胰岛素使血糖降至临界水平后，ACTH和皮质醇未能相应升高。耐量试验存在诱发低血糖性惊厥的风险，除非在糖皮质激素替代治疗一段时间后进行，否则不推荐用于疑似严重肾上腺功能不全的患者。
表格 原发性肾上腺皮质功能减退症（艾迪生病）的确诊性血清学检测
原发性肾上腺皮质功能减退症（艾迪生病）的确诊性血清学检测检查
结果
血浆ACTH
高（≥ 50pg/mL [≥ 11 pmol/L]）
血皮质醇
低（< 5 mcg/dL [< 138nmol/L]）
ACTH兴奋试验
低于正常（根据测定，30分钟皮质醇应<15-18 mcg/dL [< 414–497 nmol/L]）
持久（24小时）ACTH刺激试验
1小时的皮质醇应低于正常，且24小时时不应再进一步上升。
ACTH = 促肾上腺皮质激素
ACTH = 促肾上腺皮质激素